개발결과

SNAP25 의 클리비즈 다이어그램

'재조합 'GST-SNAP25-EGFP' 를 'Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 단백질의  클리비즈 활성을 검토하기위해 정제하였습니다. 자연계에 존재하는 '보툴리눔 톡신 Light Chain A 형'은   SNAP25의 C-terminal 부분을 클리비즈하기 때문에, GST와 EGFP 는 각각의 N-terminal 과 C-terminal 에서 25kDa 크기로 재조합되고 클리비즈 형태를 확실하게 확인하기 위해 다시 정제합니다. 75kDa 'GST-SNAP25-EGFP' 는  'Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 에 의해 50kDA 및 25kDa 단백질로 클리비즈 됩니다.

SNAP25 클리비즈

GST-SNAP25-EGFP 의 클리비즈 이후 크기변경

GST

GST

SNAP25

SNAP25

EGFP

EGFP

75kDa

50kDa + 25kDa

in-vitro SNAP25 클리비즈 분석

GST-SNAP25-EGFP

GST-SNAP25

EGFP

Buffer condition: 1mM DTT, 1mM HEPES, 1mM NaCl, 2uM ZnCl₂

Reaction : 37℃ 3hrs

SDS-PAGE loading condition

- 12% SDS-PAGE

- volt : 120V

in vitro SNAP25 클리비즈 분석

GST-SNAP25-EGFFP 단백질이 'Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40'에 의해  클리비즈 되는지 확인하기

위해 GST-SNAP25-EGFR 단백질을 in-vitro 에서 다양한 dose의

 ''Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 와 반응시킵니다.  결과적으로, GST-SNAP25-EGFP 단백질은 GST-SNAP25 (50kDa) 와 EGFP (25kDa) 로 클리비즈 되며, ''Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 의 dose 에

비례합니다.

세포 침투 분석

Vehicle

Lc

BPMed_BoLCA

1 hr

3 hr

6 hr

'Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 의 케라티노사이트 세포 투과

피부세포(케라티노사이트 ) 침투능력 

FITC가 결합 된 'Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 단백질을 케라티노사이트 피부세포에 적용 후 1~6 시간에 걸쳐 세포 내에서 단백질이 관찰됨을 확인할 수 있습니다.  이 결과는  'Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 이 피부를 투과할 수 있음을 보여줍니다.

* Treatment condition

- HaCaT cell

- Peptide : 5μm

Vehicle

Lc

BPMed_BoLCA

''Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 의 세포 투과 시험

인체 신경 세포 에서의 전달능력

FITC가 결합 된 'Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 단백질을분화 된 SiMa 세포 (인간 신경 모세포종)에 적용.  3 시간 후 세포 내에서 단백질이 관찰됨을 확인할 수 있습니다. 이 결과는 'Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 이 보툴리눔 단백질의 가장중요한 목적지인 인체 신경세포내에 전달됨을 보여줍니다.

* Treatment condition

- FITC conjugated : 5μg

- Time : 3hrs

- Method : confocal

''Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40' 의 경피 확산 시험

경피 내 확산

'Millipore의 Strat-M 멤브레인 제품을 사용하여 경피 확산 시험을 수행합니다.  30 분에서 24 시간까지 침투 한 'Methionyl r-Clostridium Botulinum Polypeptide-1 Hexapeptide-40'양을 ELISA를 사용하여 누적 빈도로 변환합니다.  24 시간이 지난 후에도 지속적으로 침투함을 확인할 수 있습니다.

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